| Descripción | El clorhidrato de doxiciclina es un inhibidor de antibióticos de tetraciclina y metaloproteinasa de amplio espectro (MMP). |
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| Catálogo relacionado | |
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| Objetivo | MMP |
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| In vitro | La doxiciclina muestra una excelente efectividad y características dependientes del tiempo contra la cepa de M. galiséptica S6 in vitro [2]. Los osteoblastos expuestos al compuesto que contiene 25 μg/ml de doxiciclina (DOX)/β-ciclodextrina (βCD) ha aumentado la proliferación celular (P <0.05) en comparación con el control de los cultivos de osteoblastos en todos los puntos de tiempo experimentales, alcanzando un máximo en la segunda semana. La actividad de la fosfatasa alcalina (AP) y los niveles de secreción de colágeno también se elevan en osteoblastos expuestos al compuesto Dox/βCD (P <0.05 vs. controles) y alcanzan un máximo después de 14 días [3]. La doxiciclina (20 nM) inhibe la producción de ECM (matriz extracelular) y la remodelación en los tipos de cultivos SMC (células de músculo liso), y la síntesis de colágenos y proteínas isopreniladas en SMC-CH (una dieta rica en colesterol) es más alta que en SMC-C (una dieta estándar). |
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| En vivo | En ratones knockout Heterocigotos (HT) COL3A1, después de 3 meses de tratamiento con doxiciclina o placebo, ratones HT de 9 meses o de tipo salvaje (WT) están sujetos a estresantes quirúrgicos de la aorta. Un aumento de 3 veces en las lesiones aórticas inducidas por el estrés encontradas en ratones HT no tratados 1 semana después de la intervención (puntaje acumulativo 4.5 ± 0.87 versus 1.3 ± 0.34 en WT, P <0.001) se evita completamente en la doxiciclina (25 o 100 mg/kg, P.O.) Grupo tratado (1.1 ± 0.56) [1]. |
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| Ensayo de quinasa | Gelatin (0.1% (w/v) is added to standard LaemmLi acrylamide polymerization mixture. Tissue extract is mixed 1:2 with sample buffer [250 mM Tris-Cl pH 6.8, 10% (w/v) SDS, 20% (v/v) glycerol, 0.005% (w/v) bromphenol blue]. Serum is diluted 1:10 with electrophoresis buffer (2.5 mM Tris, 20 mM glycine, 0.005% SDS) and mixed 1:2 with sample buffer. Twenty μLs are loaded after 10-min incubation at room temperature without boiling. After electrophoresis at 90 V, the gels are soaked in 2.5% (w/v) Triton X-100, incubated 2 to 3 days at 37°C in gelatin digestion buffer [50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 8 mM CaCl2, 10 mM ZnSO2, 0.02% (w/v) NaN3], stained in 0.05% Coomassie blue R-250 in acetic acid/methanol/water (1:4.5:4.5 by volume), destained in 10% acetic acid and 5% methanol, and scanned for lysis band intensity. The lysis band intensity is proportional to gelatinase activity and is quantified densitometrically by using One-Dimensional Scan software. The result, a number between 0.07 and 3.75, is normalized to the protein content by dividing the densitometry result with the relative optical density from the BCA protein assay kit result. El resultado se utiliza para el análisis como la unidad arbitraria. Para el total de la actividad de MMP, los resultados de las bandas de lisis de Pro-MMP-9, MMP-9 activo, Pro-MMP-2 y MMP-2 activo. Se usa un marcador de tamaño de proteína para determinar el tamaño correcto. |
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| Ensayo celular | Todos los tratamientos in vitro se realizan en cultivos SMC con una confluencia del 90%, cuando la síntesis de ECM en SMC comienza a ser evidente. La doxiciclina (20 nM) se diluye en medio de cultivo a una concentración de 10 μg/ml (20 nM), en la que no se ha informado toxicidad o variación en la proliferación de SMC cultivada primaria, así como en otras líneas celulares y el tiempo de incubación es de 48 h. SMC-C y SMC-CH se sembran a la misma densidad celular en placas de 6 pocillos y, cuando la confluencia alcanza el 90%, se agrega 1 ml de medio de cultivo a cada pozo que contiene 3.7 × 104 BQ L- [5-H3] -Proline (9.62 × 1011 BQ/mmol). Después de 48 H Incubación, las células se lisan con 0,5 ml de 0,5 mol/L NaOH durante 1 h. La solución resultante se neutraliza con una cantidad igual de 0.5 mol/L HCl, y se usan 50 μl para medir las proteínas totales con el método Bradford. Se agrega un volumen de 10% de TCA a los 250 μl restantes y se centrifugó a 13,000 g durante 15 min a 4 ° C. El precipitado resultante se disuelve en 100 μl de NaOH 0.2 mol/L, y luego se neutraliza con 1 mol/L HCl. La solución se incuba con tampón de colagenasa (Tris-HCl, pH 7,6 20 mM y concentración final de CaCl2 250 mM) y 10 unidades de colagenasa a 37 ° C durante la noche. Luego, se agregan 150 μl al 10% de TCA y se centrifuga a 13000 g durante 15 min a 4 ° C. El sobrenadante resultante se agrega a 4 ml de fluido de centelleo y la radiactividad se mide en un contador de centelleo líquido LS 600 TA. |
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| Administrador animal | Dos grupos de ratones Knockout Col3a1 heterocigotos (HT) de 6 meses de edad se tratan durante 3 meses con doxiciclina. El tratamiento está provisto de alimentos que contienen 200 o 800 mg/kg de doxiciclina. Debido a que la ingesta de alimentos medidas preliminar de estos ratones se promedia a 3.5 g/día y el peso corporal promedio de los animales es de 25 g, la dosis promedio de drogas para grupos de dosis bajas y altas es de 25 (Doxy25) o 100 (Doxy100) mg/kg por día, respectivamente. Los ratones WT y HT no tratados (de tipo salvaje) se mantienen con una dieta regular (dieta de ratón/rata NIH-07) y sirven como controles. Después de 3 meses, bajo la anestesia de inhalación general (2% del isoflurano en el oxígeno) y las condiciones asépticas, las aortas abdominales están expuestas y estresadas quirúrgicamente por la siguiente técnica: el flujo sanguíneo se detiene al ocluir la aorta abdominal contra la columna espinal con un aplicador estéril de algodón presionado a un nivel del nivel del nivel de arbustos renales. Después de 30 s, se presiona un segundo aplicador al nivel de bifurcación ilíaca y el primer aplicador se libera abruptamente, seguido de la liberación del segundo aplicador. La incisión abdominal se sutura cerrada y los ratones se devuelven a las jaulas de origen. El tratamiento continúa después de la intervención. Una semana después de la intervención, los ratones son sacrificados por una sobredosis de isoflurano. Se recoge sangre y se cosechan aortas y segmentos de colon y piel. |
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| Referencias | [1]. Wilfried Briest, et al. La doxiciclina mejora la susceptibilidad a las lesiones aórticas en un modelo de ratón para el tipo vascular del síndrome de Ehlers-Danlos. J Pharmacol Exp Ther. 2011 jun; 337 (3): 621-7. [2]. Zhang N, et al. Las interacciones PK/PD de la doxiciclina contra Mycoplasma Gallisepticum. Microbiol delantero. 2016 4 de mayo; 7: 653. [3]. Trajano VC, et al. Actividad osteogénica de la doxiciclina encapsulada con ciclodextrina en un compuesto PCL y PLGA de calcio. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2016 1 de julio; 64: 370-5. [4]. Palomino-Morales R, et al. Inhibición de la producción y remodelación de la matriz extracelular por doxiciclina en células de músculo liso. J Pharmacol Sci. 2016 25 de marzo. Epub antes de la impresión |
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